细胞转染—脂质体介导法试剂选择

 

上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

脂质体（lipofectin regeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy， Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。

细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。

转染试剂选择指南（Thermo Fisher Scientific）

一、连续细胞系 
连续细胞系 具有无限增殖的潜能，通常要比原代或有限细胞更易处理。但由于此类细胞经历过基因改变而变得具有无限增殖能力，它们在培养过程中的表现可能无法必然地反映体内状态。
 

Reagent	DNA	mRNA	RNAi	Co- delivery	Easy-to-transfect adherent cells	Hard-to-transfect adherent cells	Suspension cells
Lipofectamine® 3000
Lipofectamine® RNAiMAX
NEW Lipofectamine® MessengerMAX™
Lipofectamine® 2000

 

Symbol	Explanation	Symbol	Explanation
	DNA for expression of protein, shRNA, and miRNA		mRNA for expression of protein
	Non-coding RNA for RNAi inhibition of gene expression		Co-delivery for cotransfection of RNAi vectors and siRNAs

二、原代细胞 

原代细胞 直接分离自组织并在适当条件下增殖。因此，它们的形态学和生理特征和体内状态更为相似。但相对于连续细胞系，它们通常更难培养和转染。

在经过第一次传代培养之后，原代培养物变成了一种细胞系。源自于原代培养物的细胞系具有有限的寿命（即它们是有限细胞系），且随着传代的进行，具有最高的生长能力的细胞逐渐占据支配地位，从而造成了细胞群内的基因型和表型接近一致的情形。相对来说，这一类细胞要比原代细胞使用起来更为方便，尤其是稳定转染的克隆传代。
 

Reagent	DNA	mRNA	RNAi	Co- delivery	Primary Cells	Stem Cells
Lipofectamine 3000
Lipofectamine RNAiMAX
NEW Lipofectamine Stem
Lipofectamine MessengerMAX
Lipofectamine 2000