Western Blot之PVDF膜、NC膜、尼龙膜....

Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

这几种膜的特点

	NC膜	尼龙膜	PVDF膜
灵敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	较高	低
结合能力	80－110 ug/cm2	>400 ug/cm2	125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）
材料质地	干的NC膜易脆	软而结实	机械强度高
溶剂耐受性	无	无	有
操作程序	缓冲液润湿,避免气泡	缓冲液润湿	使用前100%甲醇润湿
检测方式	常规染色，可用放射性和非放射性检测	不能用阴离子染料	常规染色， 比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。
适用范围	0.45um 一般蛋白 0.2um一分子量小于20kD蛋白 0.1um一分子量小于7kD蛋白	低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中)	糖蛋白检测和蛋白质测序
价格	价格较便宜	便宜	较贵

1. 硝酸纤维素膜
    硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间， Schleicher & Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot结果。不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。

2. PVDF膜
    聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能（Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/肽分离/内部测序和免疫检测（Kurien,et al.,2003)。特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色。所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。此外，一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更好一些。PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染色都一样OK，但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢）。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

PVDF膜常见的有以下几个品牌

公司	产品名	孔径	适用范围	参考价格
Millipore	Immobilon Transfer Membranes	0.45um 0.2um		$212
Bio-Rad	Immun-Blot PVDF Membrane		Chemiluminescent, colorimetric western blots, amino-terminal sequence and total amino acid composition
Pierce	PVDF Membrane	0.45um 0.2um	Western, Southern, Northern, and dot blots
Pall Life Science	BioTrace PVDF Transfer Membrane	0.45um	Nucleic acid and protein transfers. Protein sequencing	$149
Invitrogen	PVDF Membrane	0.45um 0.2um	Protein sequencing, immunoblotting	￥1625.8
Whatman	Westran Clear Signal PVDF Membrane	0.45um	Western blots

   疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用MilliQ水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。

  3. 尼龙膜
    尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如dot blot，比较于NC膜来说，它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高——由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出（据分子克隆III说通过热处理的酪蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮延长封闭时间可以改善），而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。因此在许多情况下实验室人员进行WB实验不选择尼龙膜。

文章来源：生物小博的博客