Nature新发现—Tn-seq是病原菌毒力基因筛选的关键

文献档案

文献题目	Salmonella-derived haem inhibits macrophage phagocytosis and promotes infection in mice
发表期刊	Nature Microbiology（IF: 19.4）
发表团队	上海交通大学医学院姚玉峰（Yu-Feng Yao）教授团队
核心技术	Tn-seq转座子测序筛选

研究背景

沙门氏菌（Salmonella enterica）作为重要的食源性致病菌，能够侵袭巨噬细胞并在其中复制，引发全身性感染。多年来的核心科学问题是：为什么这种细菌能够如此巧妙地逃避巨噬细胞的吞噬作用？

以往研究主要关注沙门氏菌分泌的效应蛋白，但这项研究的突破在于——研究者选择了高通量、无偏好的Tn-seq筛选技术，发现了一个全新的免疫逃逸机制！

研究方法

研究团队采用了一系列前沿技术：

1. 转座子测序（Tn-seq）筛选：构建含约70,000个独立插入的沙门氏菌转座子突变文库，进行三轮巨噬细胞感染筛选，富集抗吞噬能力下降的突变株
2. 免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）：鉴定与SirM直接相互作用的蛋白质
3. 体外甲基化实验：验证SirM对HemL的甲基化修饰
4. 细胞吞噬实验：使用RAW 264.7、原代BMDM等多种巨噬细胞模型
5. 小鼠感染模型：评估SirM在体内的毒力作用
6. 信号通路分析：TLR4抑制剂、Cdc42活性检测等

核心技术|Tn-seq是如何成为这项研究的关键

什么是Tn-seq？

Tn-seq（Transposon sequencing）转座子测序技术，是通过在细菌基因组中随机插入转座子，构建海量突变体文库，然后在特定筛选条件下（如巨噬细胞感染），通过高通量测序比较输入与输出文库中转座子插入的丰度变化，从而精准鉴定出在该条件下发挥关键作用的基因。

本研究中的Tn-seq筛选策略

研究团队采用了三轮富集式Tn-seq筛选的精妙设计：

1. 文库构建：构建含约70,000个独立插入的沙门氏菌转座子突变文库，覆盖基因组绝大多数基因

2. 第一轮筛选：感染巨噬细胞2小时，收集胞内细菌，提取基因组

3. 第二轮筛选：将第一轮收集的细菌再次感染巨噬细胞

4. 第三轮筛选：重复感染过程，进一步富集抗吞噬能力缺陷的突变株

5. 高通量测序与分析：比较每轮筛选前后突变体丰度，找到持续富集下降的基因

技术亮点：

通过多轮、递进式的Tn-seq筛选，确保了筛选结果的高可信度！

筛选成果｜Tn-seq直接锁定关键基因SirM

发现一：SirM是抗吞噬的关键甲基转移酶

通过Tn-seq筛选，大大提高了关键基因的筛选效率，研究团队直接命中了STM14_1981（命名为SirM）这个甲基转移酶基因，发现了这个"非分泌蛋白"在抗吞噬中的关键作用！

深入机制｜从基因发现到通路解析

发现二：SirM通过甲基化HemL上调血红素合成

锁定SirM后，研究团队进一步通过ΔsirM背景的二次Tn-seq筛选配合IP-MS，找到了下游底物。

发现三：细菌血红素通过TLR4-Cdc42轴抑制吞噬

机制研究揭示了完整的信号通路。

• 细菌分泌的血红素作用于巨噬细胞的TLR4受体
• 抑制下游Cdc42 GTP酶的激活
• Cdc42失活导致肌动蛋白重排受阻，吞噬功能受抑
• 低至3μM的血红素即可产生显著抑制效应

 

体内验证｜从小鼠模型看SirM的毒力价值

发现四：SirM是沙门氏菌体内毒力的关键决定因子

小鼠感染实验充分验证了Tn-seq筛选发现的生理意义：

• ΔsirM感染的小鼠存活率提高60%以上
• 脾脏、肝脏和粪便中的细菌载量下降1-2个数量级
• 病理切片显示肠道和肝脏炎症损伤显著减轻

 

Tn-seq时代的病原菌研究新思路

这项研究的成功，为我们展示了Tn-seq技术在病原菌研究中的巨大价值：

• 从"假设驱动"到"发现驱动"：Tn-seq让我们摆脱候选基因的局限，在全基因组范围内寻找真正的关键因子
• 多轮筛选=高可信度：递进式筛选策略有效降低假阳性，确保结果可靠
• 表型-机制无缝衔接：Tn-seq直接连接表型与基因型，为后续机制研究指明方向
• 可推广的研究范式：这一Tn-seq筛选策略可复制到几乎所有病原菌的毒力研究中

文献原文链接：https://doi.org/10.1038/s41564-026-02341-3

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