Nature Microbiology：大规模基因组学与实验功能验证联合揭示病原菌肠道适应性演化

中国科学院大学杭州高等研究院乐敏课题组在Nature Microbiology发表了关于单相鼠伤寒沙门菌 ST34 克隆全球扩张的连续基因缺失机制研究。

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项目	内容
文献题目	Sequential gene loss promotes expansion of monophasic Salmonella Typhimurium ST34
发表期刊	Nature Microbiology
影响因子	18.7
论文作者	国科大杭州高等研究院吴小磊为本文第一作者，乐敏教授为本文通讯作者

研究背景

单相鼠伤寒沙门菌（monophasic Salmonella Typhimurium, mSTM）ST34 克隆株近年来从欧洲家禽扩展至全球畜禽及人类群体，已成为食物中毒的主要病原体之一，并逐步取代了以往占主导地位的双相鼠伤寒沙门菌（STM ST19）。双相鼠伤寒沙门菌（STM）通常通过 fliC（1相）和 fljB（2相）交替表达两种鞭毛抗原，而 mSTM ST34 因缺乏 fljB 基因而呈单相表型。过去针对局部或单一来源分离株的研究将其流行归因于获得性耐药性、噬菌体抗性以及对重金属和消毒剂的耐受性，但这难以完全解释其在全球范围内的克隆替换机制。细菌病原体变异株全球克隆扩张与肠道适应的遗传演化机制尚不明确，本研究旨在揭示驱动 mSTM ST34 大流行背后的遗传演化规律与分子机制。

研究方法与技术路线

01.大规模基因组与演化分析

整合全球 44,597 份 mSTM 与 STM 基因组数据（包含实验室测序的 689 株分离株与EnteroBase、NCBI 等公开数据库数据），开展核心基因组 SNP 鉴定、多位点序列打型（MLST）、系统发育树构建以及时间尺度演化模型（TreeTime 分子钟分析）。

02.功能基因组学与转录组学（RNA-seq & Tn-seq）

利用转录组测序（RNA-seq）比较野毒株（WT）与 dinB 突变株的表达谱差异。

利用高通量转座子插入测序（Tn-seq，Mariner 转座系统）构建突变体库并感染小鼠，筛选小鼠肠道定殖所必需的关键基因。

 

Fig.a,Workflow of transposon insertion sequencing (Tn-seq) screening.

03.体外与体内功能实验

体外表型分析：构建基因敲除与互补株，开展 DNA 损伤剂（NFZ、4-NQO、MMS）耐受性测试、过表达毒性实验、鞭毛蛋白 Western Blot、质谱鉴别及半固体平板运动抑制实验。

体内竞争实验：建立链霉素预处理的小鼠结肠炎模型，测定不同菌株及其突变体在结肠、盲肠及粪便中的定殖竞争指数（Competitive Index）。

04.群体演化数学建模

建立基于微分方程（ODE）的空间多斑块（meta-community）种群动力学模型，模拟四种主要遗传背景菌株在不同选择压力和演化顺序下的种群替换过程。

研究结果

01.dinB 移码突变的特异富集与功能重构

基因组变异筛查：对 44,597 份全局基因组分析发现，dinB 基因单碱基缺失（c.39delT 移码突变，dinBT）在 mSTM ST34 中几乎 100%（99.7%）存在。

功能缺失表型：dinB 编码 Y 家族跨损伤 DNA 合成（TLS）聚合酶 IV；dinBT 导致蛋白表达量极低，使细菌对 DNA 损伤剂（NFZ、4-NQO、MMS）表现敏感。

鞭毛调控网络重构：RNA-seq 与 Western Blot 表明，dinBT 突变下调了 fljAB 并上调了 fliC 的表达，改变了鞭毛表达模式。

 

Fig. 1 | mSTM ST34 outperforms the previously prevalent STM ST19.

02.高通量 Tn-seq 揭示肠道定殖必需基因重塑

功能基因组学筛选：构建 Mariner 转座子突变体库感染小鼠结肠炎模型，对比输入（LB 培养基）与输出（结肠组织）的插入频率.

必需性改变：在野生型（WT）菌株中肠道感染必需的鞭毛基因 fliC 与 fljB，在 dinBT 突变背景下转变为非必需（dispensable）。

 

 

Fig. 3 | Frameshift dinB rewires flagellar gene expression and essentiality.

03. 保留 fliC 与缺失 fljB 的协同竞争优势

体内竞争优势：小鼠肠道竞争定殖实验（Competitive Index）证实，dinBT 突变株具备显著竞争优势，且该优势高度依赖于 fliC 的持续表达。

fljB 缺失的叠加效应：在 dinBT 背景下缺失 fljB（及 hin-fljA 调控系统）不仅不损害定殖，反而进一步增强了结肠竞争优势。

环境选择压力协同：fljB 缺失位点常被整合有铜、银、汞及多种抗生素耐药基因盒的转座元件取代，极大提升了在现代养殖业环境下的适应性。

04. “连续基因缺失”的时序与演化建模

分子钟系统发育树：TreeTime 分子钟分析明确演化顺序——dinB 移码突变发生在先，fljB 基因缺失发生在后。

种群动力学建模：多斑块 ODE 种群模型模拟证实，若无 dinB 突变作为前置基础，单独 fljB 缺失无法产生竞争优势。

阶梯式演化路径：只有遵循“先 dinB 突变，后 fljB 缺失”的特定顺序，才能驱动克隆在全球群体中的爆发性扩张

研究结论

本研究证实基因缺失不仅是基因组退化，更是病原菌精简基因组、重构调控网络以适应特定宿主生态位的精细演化策略。揭示了养殖业选择压力（重金属/抗生素）下高风险突变株的演化规律，为未来食品安全与人兽共患病大流行预警提供了理论框架。

Tn-seq技术在本研究中的推进作用

本研究中， Tn-seq（转座子插入测序，Transposon Insertion Sequencing） 被作为一种高通量的功能基因组学筛选手段，用于鉴定沙门菌在小鼠肠道定殖所必需的关键基因，证明了 dinB 移码突变重塑了沙门菌的鞭毛基因表达与调控网络，降低了细菌在肠道环境中对特定鞭毛基因的生存依赖。这一发现解释了为何后续发生 fljB 基因缺失（即双相沙门菌演变为单相 mSTM ST34 克隆株）不仅不会降低细菌毒力，反而能在肠道生态位中赋予其竞争优势，从而证明了“连续基因缺失”模型的合理性。

 

Extended Data Fig. 6 | In vivo transposon sequencing identifies colonisation determinants. (A-D)

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